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El cultivo de tejidos vegetales in vitro se basa en el principio de la totipotencialidad celular vegetal enunciado por los botánicos Schleiden y Schwaann en 1838 y demostrado por Haberlandt (1902), que corresponde a la capacidad de una célula vegetal de formar una planta completa bajo ciertas condiciones químicas y físicas, a partir de un trozo de tejido de la planta. Según Villalobos y Thorpe (1991), cuando un inóculo con potencialidad de diferenciación, se incuba en condiciones favorables (balance hormonal) regenera un nuevo individuo.

La técnica de cultivo de tejidos vegetales in vitro, tiene diversas aplicaciones, entre las cuales se encuentran:

- Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales (micropropagación)

- Permite controlar las condiciones ambientales

- Permite estudiar diversos procesos fisiológicos

- Evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos

- Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos

- Permite la obtención de individuos uniformes

- Facilita el transporte del material

- Puede ser usada como una herramienta para mejoramiento genético de cultivos 

La técnica de micropropagación se refiere a la multiplicación de un genotipo, en condiciones asépticas de laboratorio y utilizando medios de cultivo adecuado, sin que se presente segregación de caracteres. Esta práctica permite: aumentar aceleradamente el número de plantas derivadas de un genotipo, reducir el tiempo de multiplicación, multiplicar gran número de plantas en un espacio reducido, controlar el estado sanitario del material vegetal y facilitar el transporte del material propagado in vitro.

Murashige (1974) propuso tres paso fundamentales para la micropropagción eficiente de una especie: a) establecimiento aséptico del cultivo; b) su multiplicación y c) el enraizamiento y la preparación para su trasplante al suelo. De acuerdo a Seemann (1993) además se debe considerar un estado inicial de selección y preparación de plantas madres, que considere la desinfección, nutrición y eliminación de virus cuando sea el caso.

MICROPROPAGACIÓN EN ALCACHOFA

La alcachofa en la mayoría de los países donde se cultiva, se propaga casi exclusivamente en forma vegetativa. El material de propagación se obtiene directamente de plantas adultas en el mismo campo, con lo que se corre el riesgo de propagación de plantas deficientes sanitariamente. Esto ha despertado el interés de los investigadores en desarrollar técnicas de propagación in vitro para esta especie. Sin embargo, para el caso de alcachofas precoces en entrar en producción, como es el caso de Blanca de Tudela y, por añadidura de la alcachofa tipo “Argentina”, la micropropagación no se ha desarrollado como herramienta por una pérdida de precocidad de los materiales propagados y por una tasa muy baja de multiplicación (Cavallaro et al., 2004). A pesar de ello, la propagación in vitro, se convierte en la única alternativa para propagar masiva y rápidamente  clones elite de alcachofa dentro de un programa de mejoramiento. Alta concentración de hormonas, un número elevado de subcultivos y el uso de antioxidantes han permitido el desarrollo de protocolos de propagación in vitro de alcachofa (Cadinu et al., 1994; Cavallaro et al.,  2004; Debergh et al., 1981; Draoui et al., 1993).

El proyecto con financiamiento INNOVA “Aumento del potencial productivo y comercial de la agroindustria de alcachofa mediante mejoramiento genético y optimización de factores claves en la cadena de producción”, que está siendo ejecutado por INIA, CRI Intihuasi, tiene como objetivo principal la selección y multiplicación masiva de uno o más clones mejorados de alcachofa tipo Argentina de alto rendimiento agroindustrial. Estos materiales seleccionados de diferentes sectores de la región de Coquimbo, por su productividad y uniformidad, deben ser masificados a un número tal,  que permitan hacer pruebas de su comportamiento en terreno, para media hectárea. Esto significa aproximadamente 5.000 plantas. La técnica de micropropagación permitirá contar con ese número de plantas en una temporada, lo que sería imposible a través del método de propagación tradicional.

 ETAPAS EN LA PROPAGACIÓN DE PLANTAS DE ALCACHOFA

1. Selección y acondicionamiento de explantes

El material vegetal a utilizar provendrá de plantas madres con hijuelos idealmente juveniles (4 semanas). Este debe ser colectado el mismo día que se va a sembrar ya que se ha visto disminución en el porcentaje de prendimiento cuando se colecta el día anterior a la siembra. El procedimiento resumido es el siguiente:

Colecta de hijuelos	Eliminación de hojas externas , raíces y trozos de tierra
Corte del follaje aproximadamente de 30 cm de largo	Lavado del material del exceso de tierra adherido a las raíces
Ingreso al laboratorio. Bajo agua corriente continuar el lavado, la eliminación de hojas.	Los materiales colectados de diámetro superior a los 2 cm, deben ser tratados a 50° C por 10 minutos (termoterapia)
Tamaño después del lavado y eliminación de hojas externas	Corte de la base en un rectángulo, lo que facilita la manipulación..

2. Desinfección de explantes

Las yemas se lavan con agua corriente, luego tres veces con agua destilada. En la cámara de flujo laminar se lavan con alcohol al 70% por 1 minuto para facilitar la penetración del desinfectante ya que elimina las burbujas de aire. La desinfección se realiza con hipoclorito de sodio al 2% por 12 minutos, se enjuaga tres veces con agua destilada y se sumergen en una solución antioxidante de ácido ascórbico (100 mg en 200 ml de agua destilada) que evita la fenolización de los tejidos. La solución antioxidante no se esteriliza en autoclave sino que con un filtro de 0,22 µm de porosidad. 

 

3. Medio de cultivo

Se utiliza el medio MS (Murashige y Skoog) ajustado a pH 5,7 con diferentes reguladores de crecimiento de acuerdo a cada fase de desarrollo de los explantes. Todos los materiales que ingresen a la sala de siembra incluido el medio, deben ser esterilizados en autoclave a 121° C y 1,2 k cm-2 de presión por 20 minutos

Esterilización de materiales y agua para ingreso a la cámara de siembra	Esterilización de los medios de cultivo dispensados en los frascos de crecimiento

4. Fase de inicio

Como explante se usan yemas con 3 a 4 primordios foliares. La disección se realiza bajo lupa estereoscópica en cámara de flujo laminar. La eliminación de los primordios externos y los cortes inducen a la acumulación de fenoles en el explante que impiden el desarrollo y reducen drásticamente el porcentaje de prendimiento, por lo que el corte debe ser muy rápido. Inmediatamente debe sembrase en el medio de inicio que corresponde a medio MS suplementado con ANA (0,5 ppm) y BAP (0,2 ppm). Los tubos sembrados deben ir inmediatamente a osucridad por 4 días y posteriormente aclimatar los explantes a la luz hasta llegar a los 3.000 lux. Cada 7 a 10 días se debe ir subcultivando con el mismo medio de cultivo para evitar la oxidación. Esta fase dura aproximadamente 10 semanas y las condiciones de trabajo corresponden a temperaturas de 23° C y fotoperiodos de 16 horas luz.

Preparación del material a utilizar bajo cámara de flujo laminar	Corte de los primordios bajo lupa
Extracción del meristema	La yema extraida antes de la siembra
Siembra en medio incio	Colocación de los tubos en cámara en oscuridad por 4 días

5. Fase de multiplicación

Cuando las plantas alcanzan el tamaño de 2 cm, se transfieren a un medio MS suplementado con BAP (1 ppm).  Luego de 6 semanas, cuando hay 3 a 8 brotes por planta, los brotes grandes se pueden sembrar en medio de enraizamiento. No se recomiendan más de 9 ciclos de multiplicación ya que las microplantas comienzan a perder vigor. 

Microplantas después de 10 semanas en medio de iniciación	Se extraen del medio, se limpian  y se llevan a medios de multiplicación
Cuando llegan a tener 6 a 8 brotes	Se extraen, se limpian y se separan
Los brotes pequeños van a medio de multiplicación	Los brotes grandes pueden ir nuevamente a medios de multiplicación para seguir obteniendo microplantas o ir a medios de enraizamiento

6. Fase de enraizamiento y aclimatación

Se debe promover la diferenciación de los tejidos para inducir la formación de raíces. Para ello se usa medio MS suplementado con ANA (1 ppm). Luego de 4 semanas cuando se observa la formación de sistema radical, las plantas se traspasan a un medio MS suplementado con IBA (1 ppm). Cuando las plantas alcanzan 2 cm de raíz pueden adaptarse a condiciones ambientales externas, en un invernadero con temperatura controlada de 23° C. La aclimatación ocurre aproximadamente en 6 semanas.

Planta lista para llevar a medio de enraizamiento	Plantas en medio de enraizamiento, en el estado de diferenciación radical

El proceso de aclimatación toma alrededor de 5 semanas, por lo tanto el tiempo mínimo para obtener plántulas a partir de microplantas in vitro es de 6 meses hasta 8 a 10 meses cuando es necesario modificar la concentración hormonal por una situación varietal específica y tiene la ventaja de la sanidad  y uniformidad del material obtenido

Literatura citada

Cadinu, M., Repetto, A., Leoni, S. and Carletti M.G. 1994. Effetto esercitato da tempi diversi di permanenza in un substrato ad elevate concentrazioni di NAA e IAA, sull’induzio e rizogena in carciofo “Spinoso sardo” e “Masedu”. Informatore agrario 33: 45-46.

Cavallaro, V., Castiglione, V., Avola, G. and Finocchiaro, E. 2004. Influence of different substrates on in vitro rhizogenesis process of early artichoke [Cynara cardunculus L. subsp.scolymus (L.) Hegi], Acta Hortiulturae 660:267-272.

Debergh, P., Harbaoui, Y. and Lemeur, R. 1981. Mass Propagation of globe artichoke (Cynara scolymus L.): Evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential. Physiol. Plant 53:181-187.

Draoui, N., Ghorbel, A. and Kchouk, M.E. 1993. In vitro culture of globe artichoke (Cynara scolymus L.) in Tunisia: utilization of vitromethods in artichoke improvement. Agr. Med. 123: 139-145.

Haberlandt, G. 1902. Kulturversuche mit isoliert en pflanzenzellen. Sitzungsbericht Math. Naturwiss K.K. Akademie, Wien III:69.

Murashige, T. 1974. Plant propagation throught tissue cultura. Ann. Rev. Plant Physiol 25: 135-166

Seemann, P. 1993.  Utilización de técnicas de micropropagación. In: Barriga, P.  y M. Neira (Eds.). Avances en producción y sanidad vegetal. Cultivos no tradicionales. Universidad Austral de Chile.  87-145.

Villalobos, M. y T. Thorpe. 1991. Micropropagación: conceptos, metodología y resultados. In: Roca, W. y Mogrinski, L. (Eds). . Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Cap. 6. Centro Internacional de Agricultura tropical. Cali. Colombia. Pp 127-142.